骨格形成・機能制御

 骨軟骨疾患の病態解明および疾患治療、組織再生ための基盤研究として、胎生期における骨格形成と生後の骨格形態および機能維持機構を分子生物学的、生化学的に解析している。培養細胞を用いた機能解析にとどまらず、生体内において様々な機能分子がどのような役割を果たしているかを疾患動物モデルや遺伝子改変マウスを用いて解析している。また、骨軟骨における未知の機能分子をゲノムワイドに網羅的に探索し、新規因子の機能解析を実施している。



スタッフ紹介

整形外科准教授:秋山 治彦

学際融合教育研究推進センター LIMS 特定准教授:山本 浩司

大学院:武井 大輔、塚中 真佐子、薗 隆



図1A

図1A. マウス胎児でのSox9の発現部位

1.骨格形成におけるマスター遺伝子の機能解析

 我々の骨格は、軟骨を鋳型として形成される内軟骨性骨化と間葉系組織から直接骨が形成される膜性骨化の二種類の機序で形成される。近年の研究から、骨芽細胞の発生分化および機能に必須のマスター遺伝子としてRunx2とOsterixが同定された。一方、我々は軟骨細胞の発生分化および機能にSox9、Sox5、Sox6が必須であることを様々な遺伝子改変マウスを用いて明らかにしてきた。特にSox9は生体内の全ての軟骨組織に発現し(図1A)、Sox9遺伝子を欠失した遺伝子改変マウスでは内軟骨性骨化を生じない(図1B)、さらにSox9を異所性発現させると軟骨組織を誘導することが出来る(図2)、またSox9が骨軟骨前駆細胞への細胞系譜の決定に必須であることも明らかにした。現在、未分化間葉系細胞から骨軟骨前駆細胞へのコミットメント機構の解析、Sox9転写複合体の解明に重点を置き研究している。
軟骨では、Sox9はユビキチンE3リガーゼであるWwp2の転写を誘導し、両者は結合して核内に移動する。その後、Wwp2によってメディエーター複合体の構成要素であるMed25がリクルートされRNAポロメラーゼIIを含む基本転写因子群とSox9との転写複合体が完成することを報告している(図3)。

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図1B. Sox9遺伝子を肢芽でのみ欠失させた変異マウスでは、四肢の骨格が完全欠損する。(参考業績13より)

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図2. Sox9遺伝子を肢芽で異所性発現させた変異マウスでは、四肢の変形および多指症を認める。(参考業績7より改変)

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図3. Sox9転写複合体の形成(参考業績1より改変)



2.骨軟骨細胞発生分化過程における機能分子の網羅的解析

 骨芽細胞や軟骨細胞の発生分化機序は、近年、徐々に明らかになってきている。いくつかの因子が協調的に発現し作用し合い、時間的、空間的に細胞分化と組織形成を制御していると考えられる。しかし、未だ全ての機能分子が明らかになったわけではない。我々は以前、骨軟骨培養細胞系を用いて軟骨初期分化段階や肥大化軟骨細胞に特異的に発現する遺伝子を同定し報告した。現在は、より生体内の条件に近い状態での解析を目指し、マウス個体内で一定の細胞集団を蛍光でマーキングすることにより骨芽細胞や軟骨細胞の様々な分化ステージの細胞集団を単離することに成功した(図4)。この実験系を用いてそれぞれの細胞に発現している遺伝子群をゲノムワイドに網羅的に解析し、さらに、同定されたそれぞれの因子の機能解析を実施している。同定された因子とiPS細胞誘導技術を用いて、in vitroにおいて軟骨細胞を誘導することに成功しており、軟骨再生および軟骨変性疾患への治療につながることが期待される。

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図4. 未分化細胞を赤色蛍光で標識したマウス胎児(左)と骨軟骨前駆細胞を緑色蛍光で標識したマウス胎児(右)



3.骨組織構築および機能維持機構の解析

 我々の骨組織は、骨格による個体形態保持および生体内カルシウム濃度恒常性維持という重要な役割を担っている。骨組織構築には様々な因子が関与していることが従来の研究から明らかになっているが、我々はWntシグナル系と副甲状腺ホルモンによる骨形成および骨量制御機構の解析を行っている(図5)。また、骨組織に特異的に分泌されている新規蛋白質を発見し、その機能解析も行っている。また骨芽細胞をマウス生体内で赤色蛍光でマーキングした遺伝子改変マウスを用いて、生体内での骨形成過程を可視化し解析している(図6)。

図5
図5. マイクロCT(左)および樹脂包埋硬組織切片(右)による骨形態計測

図6
図6. マウスcalvariaの実体顕微鏡像および二光子励起顕微鏡像



4.関節軟骨の基礎研究と変形性関節症

 骨格の長軸方向の成長は成長軟骨帯の軟骨細胞の一方向性増殖、成熟、分化による。一方、骨格の接合部、いわゆる関節は、関節軟骨で被われており関節の超低摩擦性滑動を実現している。この両者は組織学的に差異があるにもかかわらず、細胞分子生物学的な相違は理解の域に達していない。我々は、関節の発生のメカニズム、関節軟骨固有の機能因子の同定などの基礎研究を行っており、さらにその基礎研究成果をヒトの変性疾患である変形性関節症の病態(関節軟骨の変性、骨棘形成など)および治療(遺伝子導入治療や細胞移植による関節軟骨再生など)に応用している。事実、Sox9を関節軟骨で高発現させたマウスでは変形性関節症の発症および進行が抑制されている。よってSox9は軟骨変性疾患における創薬ターゲットとして有望である。また、Wntシグナルによる関節軟骨変性マウスの解析からWntシグナル系も疾患治療のターゲット候補であることが明らかになってきている。



参考業績


  1. Yukio Nakamura, Koji Yamamoto, Xinjun He, Bungo Otsuki, Youngwoo Kim, Hiroki Murao, Tsunemitsu Soeda, Noriyuki Tsumaki, Jian Min Deng, Zhaoping Zhang, Richard R. Behringer, Benoit de Crombrugghe, John H. Postlethwait, Matthew L. Warman, Takashi Nakamura, and Haruhiko Akiyama. Wwp2 is essential for palatogenesis mediated by the interaction between Sox9 and mediator subunit 25. Nature Communications 2, Article number: 251. 2011
  2. Kenichiro Furuyama, Yoshiya Kawaguchi, Haruhiko Akiyama, Masashi Horiguchi, Sota Kodama, Takeshi Kuhara, Shinichi Hosokawa, Ashraf Elbahrawy, Tsunemitsu Soeda, Masayuki Koizumi, Toshihiko Masui, Michiya Kawaguchi, Kyoichi Takaori, Ryuichiro Doi, Eiichiro Nishi, Ryosuke Kakinoki, Jian Min Deng, Richard R. Behringer, Takashi Nakamura, and Shinji Uemoto. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nature Genetics, Jan;43(1):34-41. 2011
  3. Youngwoo Kim, Hiroki Murao, Koji Yamamoto, Jian Min Deng, Richard R. Behringer, Takashi Nakamura, and Haruhiko Akiyama. Generation of transgenic mice for conditional overexpression of Sox9. J Bone Miner Metab. Jan;29(1):123-9. 2011
  4. Tsunemitsu Soeda, Jian Min Deng, Benoit de Crombrugghe, Richard R. Behringer, Takashi Nakamura, and Haruhiko Akiyama. Sox9-expressing Precursors are the Cellular Origin of the Cruciate Ligament of the Knee Joint and the Limb Tendons. Genesis. Nov;48(11):635-44. 2010
  5. Kimura H, Kwan KM, Zhang Z, Deng JM, Darnay BG, Behringer RR, Nakamura T, de Crombrugghe B, Akiyama H. Cthrc1 is a positive regulator of osteoblastic bone formation. PLoS ONE. Sep 9;3(9):e3174. 2008
  6. Jianjian Zhu, Eiichiro Nakamura, Minh-Thanh Nguyen, Xiaozhong Bao, Haruhiko Akiyama, Susan Mackem. Uncoupling Sonic hedgehog control of pattern and expansion of the developing limb bud. Dev Cell. Apr;14(4):624-32. 2008
  7. Haruhiko Akiyama, H. Scott Stadler, James F. Martin, Takahiro M. Ishii, Philip A. Beachy , Takashi Nakamura , and Benoit de Crombrugghe. Misexpression of Sox9 in mouse limb bud mesenchyme induces polydactyly and rescues hypodactyly mice. Matrix Biology, 26, 224-233, 2007
  8. Rika Nakanishi, Motoyuki Shimizu, Masayuki Mori, Haruhiko Akiyama, Shuzo Okudaira, Bungo Otsuki, Maiko Hashimoto, Keiichi Higuchi, Masanori Hosokawa, Tadao Tsuboyama, Takashi Nakamura. Secreted Frizzled-Related Protein 4 is a negative regulator of peak bone mineral density in SAMP6 mice. Journal of Bone and Mineral Research, 21(11), 1713-1721, 2006.
  9. Haruhiko Akiyama, Jung-Eun Kim,Kazuhisa Nakashima, Gener Balmes, Naomi Iwai, Jian Min Deng, Zhaoping Zhang, James F. Martin, Richard R. Behringer, Takashi Nakamura, and Benoit de Crombrugghe. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc. Nat’l. Acad. Sci.,102(41), 14665-14670, 2005.
  10. Haruhiko Akiyama, Jon P. Lyons, Yuko Mori-Akiyama, Xiaohong Yang, Ren Zhang, Zhaoping Zhang, Jian Min Deng, Makoto M. Taketo, Takashi Nakamura, Richard R. Behringer, Pierre D. McCrea, and Benoit de Crombrugghe. Interactions between Sox9 and beta-catenin control chondrocyte differentiation. Genes Dev. 18(9), 1072-1087, 2004
  11. Haruhiko Akiyama, Marie-Christine Chaboissier, Richard R. Behringer, David H. Rowitch, Andreas Schedl, Jonathan A. Epstein, and Benoit de Crombrugghe. Essential Role of Sox9 in the Pathway that Controls Formation of Cardiac Valves and Septa. Proc. Nat’l. Acad. Sci.,101(17), 6502-6507, 2004.
  12. Haruhiko Akiyama, Marie-Christine Chaboissier, Richard R. Behringer, David H. Rowitch, Andreas Schedl, Jonathan A. Epstein, and Benoit de Crombrugghe. Essential Role of Sox9 in the Pathway that Controls Formation of Cardiac Valves and Septa. Proc. Nat’l. Acad. Sci.,101(17), 6502-6507, 2004.
  13. Haruhiko Akiyama, Chaboissier MC, Martin JF, Schedl A, de Crombrugghe B: The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes Dev. 16(21), 2813-28, 2002.
  14. Hiromu Ito, Haruhiko Akiyama, Hiroshi Iguchi, Ken-ichi Iyama, Masahiro Miyamoto, Kunitaka Ohsawa and Takashi Nakamura: Molecular cloning and biological activity of a novel lysyl oxidase-related gene expressed in cartilage. Journal of Biological Chemistry, 276(26), 24023-24029, 2001
  15. Haruhiko Akiyama, Yuji Hiraki , Makoto Noda, Chohei Shigeno, Hiromu Ito, and Takashi Nakamura: Molecular cloning and biological activity of a novel H-Ras suppressor gene predominantly expressed in skeletal muscle, heart, brain and bone marrow by differential display using clonal mouse EC cells, ATDC5. Journal of Biological Chemistry, 274(45), 32192-32197, 1999