京都大学医学部附属病院耳鼻咽喉科・頭顎部外科

研究者の方へ

聴神経再生研究 聴神経機能再生 “Creation” or “Addition”?

はじめに

2009年に「聴神経機能の再生」を本ホームページにアップロード致しましてから6年余りの時間が経過し、その間、いくつかの聴神経機能再生の研究成果が発表されました [19,115]。そこで今回は、それらの研究成果も盛り込みつつ、内容・付図を全改訂いたしました(なお、多様な方々にアクセスいただいておりますことから、基本的な付図はそのまま残してあります)。以下では、細胞移植による聴神経機能再生について、特に臨床応用を視野に置きつつ、私なりの考えを述べてみたいと思います。

 ところで、ほ乳類の聴覚神経系は高度に特化した感覚神経系で、形態上は確かに特殊化している部分もあります。しかし、聴覚神経系の変性過程には、大脳・脊髄の神経変性疾患 (Parkinson病、筋萎縮性側索硬化症ALS、多発性硬化症、Huntington病など) と共通するメカニズムが働きます。たとえば、有毛細胞変性による難聴では、脳幹~大脳皮質の聴覚神経路でも神経細胞死が起こり、glia細胞が活発に活動するようになります [7,26,56,86,111,142] (後述)。以上のような背景から、本稿では、難聴を神経変性疾患の一つと見なすことによって [117]、大脳・脊髄における研究成果をもできる限り引用しながら考えて行きたいと思います。

 

ほ乳類の聴神経には、自己再生能がありません。これに対して、カエルなどの両生類の聴神経には旺盛な自己再生能があります [92,143]。 これと関連して、切断された脊髄もゼブラフィッシュなどの魚類やサンショウウオなどの有尾両生類では良好に再生します [33,48,98,129]。これら動物のadultには、脊髄中心部から表面に向けて突起を伸ばすependymogliaという細胞群あり、再生過程で重要な役割を果たします [129]。一方、ほ乳類でもependymoglia様の構造が発生段階で一時的には出現しますが、adultになると消失してしまいます [129]。また、ほ乳類の中枢神経細胞死ではglia細胞由来のglial scarが必発して神経再生を強力に阻害しますが、魚類や両生類ではglial scarは発生しません [20,28,40,98,129]。Glial scarは、glia細胞(主として、astrocyte星状膠細胞)からできるscar(瘢痕組織)で、中枢神経系にできる一種の「きずあと」のようなものです。Glial scarができた部分は硬くなりますので、「硬化 (sclerosis)」と呼ばれます。すべての神経変性疾患では、「中枢神経細胞死」 → 「glial scar形成」 →  「硬化」という病的過程が見られます。一例として、 筋萎縮性側索硬化症ALSは、「側索」(運動神経の束である錐体路が走っている)が「硬化」する疾患で、その結果として筋肉が萎縮します。ですから、病態としては「側索硬化性筋萎縮症」です。

Glial scarは硬い組織であるため神経突起がその中を通過できないという物理的側面がありますが、それに加えてglial scar内に沈着しているChondroitin sulfate proteoglycans (CSPG) の側鎖GAG (glycosaminoglycan) がligandとして神経細胞(移植された神経細胞も含む)上に発現している再生抑制性受容体receptors (receptor protein tyrosine phosphatase sigma (RPTPσ), leukocyte common antigen-related (LAR) phosphatase, Nogo receptors 1 and 3 (NgR1 and 3) など) と結合、その結果、神経再生が阻害されるというメカニズムが発見されています [21,34,123]。

魚類や両生類では、脊髄切断部分にependymal cellなどの細胞が集まってきて、切断間隙を埋めて架橋 (bridging) します。次に、そのようにして出来たglial bridgeを足場 (scaffold) にして再生神経線維が走行するようになり脊髄再生が起こります。この場合、bridgeにはnestin(vimentinを観察した報告もある)が発現しています [20,33,48,98]。一方、後述するラット聴神経圧迫損傷モデルでも、聴神経切断部にnestinが発現しましたが一過性で、やがてglial scar特有のGFAP (glial fibrillary acidic protein) 発現によって置き代えられてしまい、聴神経が自己再生することはありませんでした [115]。

以上のことから、中枢神経系の自己再生のためにはependymogliaのような細胞群が存在していることやnestinが遷延して発現するメカニズムが必要条件の一部だと考えられます。しかし、たとえばnestinをoverexpressionさせたり、GFAPの発現を抑えたりする遺伝子操作は、中枢神経系に深刻な形態学的・機能的な異常を引き起こしますのでヒトでは使えません [81,91]。

このような背景から、聴神経の自己再生に期待するのではなくて、原理的にはヒトにも応用可能な「細胞移植」によって聴神経機能を再生させようと考えた、これが私たちの研究の出発点でした。このような発想に先立つ2001年に、聴覚神経系における細胞移植治療の可能性が初めて示されました [59]。このことが、私たちの聴神経機能再生研究を大きく後押したことも事実です。

 

「聴神経の機能再生」は、難聴を治療する上で必須である

聴覚再生の観点から聴覚神経系を3つの部分に分けて考えます。すなわち、 ①有毛細胞 (hair cell)、 ②聴神経 (auditory nerve) (同義語として、蝸牛神経cochlear nerve, ラセン神経節細胞 spiral ganglion neuron or cell)、 ③蝸牛神経核 (cochlear nucleus) とそれよりも高位の神経核と神経路の3部分です (図1)。聴神経は有毛細胞と蝸牛神経核の間に位置していて、 その両端にはシナプス (synapse) という構造があります。つまり、聴神経は神経突起を末梢側と中枢側に伸ばしている双極性神経細胞 (bipolar neuron) です。

 

sekiya


図1 有毛細胞、 聴神経、 蝸牛神経核の位置関係

感音性難聴 (学術的には、感音難聴と呼ぶ) の最も多い原因は、有毛細胞障害です。一部の抗生物質や抗癌剤の使用、 過度の騒音環境、 遺伝的要因など、その原因は多岐にわたります。有毛細胞が障害されると、 その影響はシナプスを越えて聴神経まで及び、聴神経までも変性します (trans-neuronal degeneration) (図2 矢印A)。このように、有毛細胞変性が引き金になって続発的に聴神経も変性してしまう現象(二次性聴神経変性)は、ラットなどでは相当な速さで進行しますが、ヒトではその進行速度が遅いことが知られています [105]。これが、「人工内耳」がヒトで適用できる大きな理由です。つまり、ヒトでは有毛細胞が消失しても聴神経が生き残っている期間が長いので、残っている聴神経を電気刺激すれば聴覚を獲得することができるようになります。しかし、残存している聴神経の数が極端に少なくなってしまっている場合などには、人工内耳が使えません。このような場合、細胞移植によって聴神経数を増やすことができれば、人工内耳が使えるようになる可能性があります。最近では、有毛細胞が変性消失した症例に対して人工感覚上皮を内耳内に挿入して機能させる研究も行われるようになっていますが [58]、この場合にもやはり聴神経が機能していることが前提条件となります。

10 年ほど前から、auditory neuropathyという難聴の一型が認識されるようになりました [61,128]。現在ではauditory neuropathyはさまざまな病態を含むことが分かってきていますが [60]、「auditory neuropathic typeの hearing loss」という表現が使われるようになっています [19]。これは、蝸牛内の有毛細胞は正常に機能しているが、聴神経だけが選択的に変性脱落している病態を指して使用されています (図2矢印Bは、上向き黒矢印で聴神経が直接損傷されたときに、聴神経変性がラセン神経節細胞に及ぶことを示しています。この場合には、有毛細胞は障害されません)。したがって、auditory neuropathyの中には聴神経再生治療の対象となるものが含まれている可能性があります。

最近、老人性難聴においても聴神経が選択的に変性するタイプがあることや騒音によって遅発性に聴神経だけが変性する現象も知られるようになってきました [66,76]。これらも聴神経再生治療の対象となる可能性が出てくると考えられます。

前庭神経鞘腫 (vestibular schwannoma、過去には聴神経鞘腫acoustic neurinomaなどと呼ばれた) という脳腫瘍があります。10万人に1人ほどの率で発生する良性腫瘍です。これは前庭神経から発生しますが、やがてすぐそばにある聴神経を圧迫するようになって難聴が自覚されるようになります。前庭神経鞘腫を治療する上での大きな問題は、手術またはガンマナイフなどによる治療直後には温存された残存聴力が、長期間(10年前後)観察していると加齢現象以上の速度で悪化していくという事実が知られるようになったことです [136]。治療行為自体が、聴力の長期温存の観点からはその悪化誘因になることが示されたことになります。このような経過をたどった症例では、治療直後には聴力が残っていたので聴神経は形態的には残っていたわけですが、時間経過と共に変性硬化して機能を失ったと考えられます。したがって、細胞移植による聴神経機能再生の好対象になりうると考えられます。

聴神経の解剖と病態

図2 聴神経の解剖と病態
(cited from Sekiya, T, et al., Frontiers in Bioscience 13, 2165-2176, 2008)

(出版社の許可を得て転載)http://www.bioscience.org/2008/v13/af/2832/fulltext.htm

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聴神経は、中枢神経変性・再生研究への窓 (window) ともなる

脳神経が脳幹から出て行く (または入ってくる) 部位 (root exit zone, root entry zone) には、中枢神経に属する部分と末梢神経部分の「つなぎ目」があり、Transitional zone (TZ)と呼ばれ末梢方向に凸の形をしています(図2, 3左)。神経内部のaxonは中枢から末梢(末梢から中枢)まで連続して走っていますが、axon周囲の環境がTZを境にして大きく変化します。TZよりも中枢側のaxon (図2 実線で示した部分) は、oligodendrocyte由来の中枢性myelin (CNS myelin) によって被覆されていて、 axon間はastrocyte によって隙間なく埋められています(図3左)。これに対して、TZよりも末梢のaxon (図2 点線で示した部分) はSchwann細胞由来のmyelin (PNS myelin) で被覆されていて、axon間にはendoneuriumがあります。以上のことから、脳幹や脊髄本体からTZまでは、本質的に中枢神経に属していると見なすことができます [42]。このTZの位置は脳神経ごとに異なりますが [130]、聴神経のTZは他の脳神経と比べると例外的に末梢寄りに位置しています (図2)。つまり中枢神経系に属する部分がたいへん長く、この部分(聴神経の中枢神経部分)へは、耳の後ろに小さな開頭を行うことで到達することができます。最近、聴神経の中枢神経部分に生じるglial scarが、大脳や脊髄に生じるものと同じ性質を示すことが示されました [115]。したがって、聴神経変性・再生を研究することによって、脊髄損傷(以下、脊損)やいわゆる難病とされている神経変性疾患の治療につながる知見が得られる可能性があります。様々な神経路が複雑に走行している大脳や脊髄と比べると、聴神経は解剖学的に比較的単純な構成をしているので、神経変性過程の解析や治療効果の判定などを格段に容易に行えるという大きな利点もあります。

一般的に、末梢神経内に移植された細胞から伸長してきた神経突起は、TZでastrocyteと遭遇すると突如として伸長が止まります [65]。同様に、末梢側から遊走 (migration) してきた移植細胞もTZで動きが制限されます [132]。これは、中枢神経部分にastrocyteが存在しているからであると考えられています。また、astrocyteは、外傷、虚血、照射、遺伝子異常など神経細胞死 (neuronal cell death) を生じる病態の下では、原因のいかんに関わらず不可避的にreactive astrocyteに変化し、最終的にはglial scarを形成するに至ります [22,67,100]。前述しましたように、glial scarは神経再生を強力に阻害しますので [14,28,99,125,138]、中枢神経系の細胞移植治療は「如何にしてglial scarの神経再生阻害性を克服するか」にかかってくると言っても過言ではありません。病変による侵襲によってastrocyteが盛んに増殖し不可逆な瘢痕が生じるのがglial scarですが、これに対して、原因病変が治癒することによって回復するような軽度の反応としてのastrogliosis ないしはgliosisがあります [126]。慢性疾患としての難聴では、その原因(有毛細胞変性など)は持続しますので、聴神経を含む聴覚神経系にglial scarが次第に形成されて行くことになります。

聴神経が最初に変性する場合(一次性聴神経変性)、聴神経から蝸牛神経核にかけてglial scarが観察されるようになります。このような変化は、ラット聴神経に圧迫損傷を与えたときに見られます [115,117,121](下述「Mechanical compression model」の項も参照)(図2B, 3右)。聴神経が圧迫損傷を受けた結果、聴神経細胞死(ラセン神経節細胞死)が起こり、続いて蝸牛神経核死が起こります [122]。この変化にastrocyteが反応して著しく増殖して聴神経の末梢神経部分まで占拠するようになり、結果的に聴神経全体がglial scarによって占められるようになります [115,121](図 3右)。同じように、前述した前庭神経鞘腫はTZ近傍から生じて脳幹方向に増大し、聴神経を機械的に圧迫するようになります。聴神経が圧迫されている状態を、腫瘍摘出手術中につぶさに観察することができることもあります。

 

図3 正常聴神経(左)と圧迫損傷後の聴神経(右)

正常聴神経(左):聴神経の中枢神経に属する部分 (CNS-P) にはastrocyteが存在しているので、GFAP抗体で緑に染まっている。一方、末梢神経部分にはastrocyteが存在しないので、聴神経の中枢神経部分と末梢神経部分の境界 (Transitional zone, TZ) が明瞭に分かる。3個の矢印は、Rosenthal’s canal内の多数のラセン神経節細胞(聴神経の細胞体)を示している。AuN; 聴神経, PNS-P; 聴神経の末梢神経部分。

圧迫5週間後の聴神経(右):astrocyte由来のglial scarが聴神経の末梢まで占拠するようになって、聴神経全体が瘢痕化している(4個の矢頭)。また、聴神経全体が変性萎縮して細くなっているのが分かる。Glial scarの突起は、Rosenthal’s canalの中まで入り込んでいる(2個の星状マークで示す)。聴神経変性が起こり、Rosenthal’s canal内のラセン神経節細胞はほぼすべて消失している(矢印)(正常状態=左と比較のこと)。二重矢印は、聴神経が圧迫された部位を示す。ここで見られているような像(glial scar由来のastrocyteの突起が末梢方向にも伸びて、聴神経内にも出現するようになる)は、有毛細胞変性後にも観察される(本文参照)。bar, 200μm.

 (cited from Sekiya et al., Proc Natl Acad Sci U S A 112(26): E3431-3440, 2015)

音響外傷などによって有毛細胞変性が起こる場合、蝸牛神経核、内側膝状体、下丘、大脳皮質聴覚野などの聴覚神経路に神経細胞死が起こることは動物実験で証明されていますが [7,26,86]、最近では、ヒトMRIの画像解析から難聴者の大脳皮質聴覚野の神経細胞死が示されています [56,142]。音響曝露後の有毛細胞変性によって脳幹の聴覚神経路に神経細胞死が起こり、同時にglia細胞が著しく増加することが報告されています [111]。抗生物質による有毛細胞変性の後にも、GFAP陽性のastrocyteの突起がTZを越えて聴神経全体で観察されるようになることが動物実験で示されており、脳幹に生じたglial scarから伸びたastrocyteの突起が聴神経の末梢部でも観察されたことを示しています [55]。

大脳や脊髄ではglial scarと神経変性・再生の問題が大いに検討されてきましたが、聴覚神経系でglial scarが問題にされることは必ずしも多くありませんでした。その最大の理由は、動物実験やヒト剖検例で聴覚神経系がGFAP抗体(glial scarの代表的マーカーの一つ)で染色されることが少なかった~またはほとんどなかったということがあったのかもしれません。このようなとき、「難聴に伴って起こる様々な症状は、内耳内の変化だけでなくさらに中枢側で起こっている変化を知ることで、より合理的に説明できるようになる」というotologistの指摘は傾聴に値するものと言えましょう [7]。

聴神経再生と神経突起伸長

一般に、移植細胞が生着して機能するためには、①移植細胞自体に備わっている内部プログラム (internal molecular program) と ②移植細胞が周囲の環境から受け取るlocal environmental cuesが必要だと考えられていますが [119]、①の方がより重要で、未分化な幹細胞がlocal environmental cuesを受け取って分化・生着・機能することはあまり期待できないようです [74,75]。聴覚神経系においても、聴神経の前駆細胞 (progenitor or precursor cells) 移植によって、聴神経機能再生が動物実験で達成されています [19,115]。

ところで、神経突起を伸ばす (neurite extension またはelongation) と細胞遊走 (cell migration) は、密接に関連した現象です [32]。なぜなら、細胞はゴロゴロと転がりながら自走するのではなく、まず細胞体から先行する神経突起 (leading process) が伸びて、その場所まで細胞体が引きよせられるという一種の「尺取り虫様」の運動を繰り返しながら移動するからです [135]。ラットの実験でも、移植された細胞が長い神経突起を伸ばしながら末梢方向に移動する様子が見られ、伸びた神経突起が最終的には末梢と中枢の標的細胞(有毛細胞と蝸牛神経核細胞)とシナプスを構成し、聴性脳幹反応 (ABR) も改善していました [115]。また、移植3ヶ月後に最も多くの細胞が見られたのは内耳道底でした。移植細胞は、ラセン神経節細胞(聴神経の細胞体)が本来の存在する部位(Rosenthal’s canal, 図2, 3)に最も近接した部位に一塊にまとまって存在していました [115]。これは、移植細胞(聴神経前駆細胞)が聴神経細胞(ラセン神経節細胞)としての性格を持っていたために、一種のhoming(帰巣回遊現象)を示したものと考えられます。

神経突起伸長のメカニズムについては、「まだ表面をかすった程度 (only scratch the surface) 」と言う研究者もいるほど不明の点が多いことも事実ですが [32]、図4にこれまで分かっていることについて、その骨格部分を示しました [8,25,32,49,70,77,82,97,119,127]。この図は聴神経以外の神経細胞から得られた研究成果ですが、聴神経に関しても同様のメカニズムが働くことが確かめられつつあります(下述)。図 4は、聴神経再生と関連づけて、以下のように読むことができます。

① 出発点になる部分には、GTPase (Rho, Rac, Cdc42) があります。GTPaseは、GEFによってGDPがGTPに変化、結果的に各々のGTPaseが活性型となって下流に作用するようになります。逆に、GAPが作用すると下流の諸反応は抑制されます。

② 神経突起の伸長:actin monomerがCofilinによって基部から切り離されてG-actinとなる →  G-actinがProfilinによって神経のbarbed endの成長円錐 (growth cone) 部分に運ばれて、そこに積み上げられて行く → これが次々に繰り返されることによって神経伸長が見られます。Arp2/3とWASP/WAVEの部分は、側枝を出すメカニズムを示しています。以上の経路には、ROCK, LIMK, PAKを介する経路が促進的または抑制的に作用します。mDiaを介する経路は、活性化されたGTPaseがProfilinの作用を促進して神経伸長を促します。この図からROCK inhibitorが神経伸長を促進する可能性が示唆されますが、聴覚神経系でもその効果が試されています [31,96]。

③ Myosin IIがcontractionすると、上述②とは逆に神経突起伸長が抑制されます。この作用は、ROCK, MLCK, MLC phosphataseなどがMLCをリン酸化・脱リン酸化することによって生じます。

④ 神経線維の先端の成長円錐の部分は、150個を越える多数の分子 (図4ではTalin, alpha-actininのみを示した) を介してIntegrinと接着 (adhesion) しています。Integrin receptorは、ECMにあるligand (laminin, fibronectin)と結合することによって細胞内にsignalを伝達しますが、この経路によって聴神経が神経突起を伸長することがin vitroで示されています [3,38]。Adhesion部分にある分子群 (Adhesion-associated complexes) 内のFAK/Paxillinは、Rac GEF, Rho GEFにsignalを送る「センター」としての機能もあります。

⑤ これまで古典的に知られてきた細胞外のguidance cues であるSlits, netrins, ephrins, semaphorins のすべてが、各々のreceptors (Robo, DCC, Eph, plexin) を介して聴覚神経系でも作用することが知られています [24,97]。聴神経に関しては、そのpathfinding過程 (Eph/ephrin, Sema3A) [31,51] やラセン神経節細胞を一塊としてまとまめる過程 (Slit/Robo) (positioning of the spiral ganglion cells) [137] などでこれらのmoleculesが関与します(図4では図が複雑になるのを避けるために、Slit-Robo, ephrin-EphがそれぞれGEF, GAPに作用して下流経路を促進または抑制する様子の一部のみを例示しました)。

図4 神経突起の伸張のメカニズム

(Sekiya, T, et al., Frontiers in Bioscience 13, 2165-2176, 2008内の図を改訂)

 

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「細胞移植によって再生可能な神経回路」とは? その条件について

神経機能再生研究は、脊損によるparaplegia(両下肢完全麻痺)などの重篤な運動障害の治療に向けた努力と共に発展してきたと言っても過言ではありません。しかし、そもそも一度切断されたほ乳類の錐体路(皮質脊髄路)内の運動神経が再生し、元々支配していた四肢筋肉群を再支配するようになるという事、たとえば、交通事故、労災事故などによって頸椎レベルで切断された運動神経が、そこから途切れることなく再生して腰椎レベルにまで到達して下肢機能が回復することなどは、実際にヒトでは起こりがたいのではないか。。。とする意見があります [13]。

一方、脊損後の運動回復がsproutingとrelay neuron (interneuron) などを介して可能となって行くことはラットなどで証明されています [6,27]。ラット錐体路が頸部で部分切断されたとき、切断部よりも近位部の錐体路線維からsproutが起こり、その新しくできた側枝が脊髄に元からあるpropriospinal neurons (PSN) とシナプスを形成、そのPSNが腰椎の下位運動神経を支配することで下肢運動機能が戻ることが証明されています [6](図5 A, B)。つまり、上位運動neuron → PSN → 下位運動neuronという神経興奮の流れが再構築される、つまりPSNが情報の中継ぎ (relay) をすることになります。このアイデアを一歩進めると、PSNの代わりに細胞を移植して、移植細胞をrelay neuronとして作用させることによって運動機能回復をはかるというアイデアに至ります。これを実験的に試みた報告は多くあります [1,11,73]。おそらく、このような方法の方が錐体路の直接的再建よりもより現実的でしょう。

錐体路内の運動神経再建が困難である最大の理由は、切断部からtargetまでの距離が極めて長いということにあります。錐体細胞には、50 cm以上の長さの神経突起を持つものもあります。しかし現時点では、移植細胞が50 mm程度(近位部と遠位部方向の合計)の神経突起を伸ばすのが限界だと思われます [73]。いずれにしても、500 mmと50 mmとでは一桁違います。移植細胞によって連結しなければならない距離が短い神経路の方が有利であることは自明です。

この点を考えると、聴神経はたいへん有利です。ヒト成人の聴神経は、内耳孔から内耳道底までが約11 mm、内耳孔から脳幹表面 (root entry zone) までが約15 mmです [69,146]。内耳道底から有毛細胞基部までの距離(1 mm以下)[145] を合算した上でさらに大きく余裕をみても、移植細胞は合計30 mmの長さの神経突起を伸ばせば充分という計算になります(細胞体が中央にあると仮定すると、双方向に15 mmずつ以下でよいことになる)。このように距離が短いのでrelay neuronは不要となり、正に字義通りのneuronの入れ替え (replacement) でよい可能性が高いことになります。もし有毛細胞と蝸牛神経核間にrelay neuronが必要だとすると、bipolar neuronとmonopolar neuronが混在せざるを得ません(図5 D)。Relay neuronが1個余計に入るモデル(図 5 D)ではdefaultの状態(図 5 C)よりもsynapseが1個増えるので、synaptic delay(神経興奮の伝導速度がsynapse部分で遅れる現象、通常0.5 ms程度)が1個分だけ多く生じることになります。しかし、聴神経再生実験での聴性脳幹反応 (ABR) の潜時測定から、そのような追加のsynaptic delayは生じていませんでした [115]。したがって、聴神経機能再生はrelay neuronなしでdefaultの状態を再構築することが可能でした(図5 C)[115]。

 

sekiya

図5 錐体路と聴神経系の機能再生(本文参照)

(Bの青矢印は脊髄損傷などによる錐体路内の運動神経線維切断を示す)

 

細胞移植:何をもって神経再生治療のgoalとするか?

現在まで、脊損や神経変性疾患に対する細胞移植実験の結果が多数報告されてきましたが、ここで重要なことは、「何をもって再生治療が成功したとみなすべきか?」ということです。

 一例としてParkinson病についてみると、ほとんどの報告で移植細胞 (dopaminergic cells) が線条体、特に被殻 (putamen) に移植されています。しかし、本来は中脳黒質に移植されたドーパミン産生細胞が神経突起を伸ばして線条体に到達し、そこでsynapse間隙にドーパミンを放出するのが生理的状態です。しかし、多くの研究者は、そのようなdefaultの解剖学的構成を再構築することは困難であると考えているために、ドーパミン産生細胞を基底核線条体に直接移植しているという意見があります [103,106]。本来の解剖学的構成を度外視した一種の代替案であると言えます。しかし、この方法では、シナプスによる制御を受けないで放出されたドーパミンが線条体に異常蓄積し、本来刺激されるべきではない周辺神経回路までが刺激されてしまうという危険性があります [18]。これに関連して、Huntington病患者に胎児線条体組織を移植したところ、その移植片がどんどんと無制限に大きくなって、脳室を圧迫するほどまでになったという報告もあります [45]。これはおそらく、移植片または移植細胞の腫瘍化とも関連する問題でしょう。

 移植細胞が細胞の受け手側 (host) の神経回路に取り込まれたことを証明するためには、光顕または電顕でのsynaptic labellingの証明が必須で、これに加えて再現性のある機能的回復を証明する必要があります [5,11,13,140,141]。しかし現状では、シナプス再構築の証明がないまま機能回復が見られたとする実験結果が大半を占めていることも事実です。このような場合、観察された効果は神経回路が再構築されたためではなく、移植細胞がもたらしたnon-specific な、またはby-stander なものであろうと考えられており、その中には、移植細胞によるtrophic effect, immunomodulation などが含まれるとされています[2,9,12,29,47,50,79,84,87,90,93,107]。

以上のことから、真に求められる神経機能再生は、解剖学的神経回路の再構築またはそれに類似したシナプス制御を受けるような回路の再構築であることが理解されます [138]。

 

動物実験モデルの作成

神経変性疾患治療のための創薬の歴史を見てみると、「動物実験モデルの段階では効果があったが、それが臨床の場では効果がなかった」ということがしばしば起こっています。一例を挙げると、動物実験モデル段階では効果があったALS治療薬について、これまで30件以上の大規模臨床研究が行われましたが、ヒトに効果があるものは皆無だったと言われています [36,52,101]。このような実験動物とヒトとの間で見られる深刻な薬効乖離現象の最大の原因は、動物実験モデルがヒトの病態を正確に反映していないことにあり、疾患モデル確立の困難性が如実に示されています [87]。極言するならば、完全にヒトと等価な現象を動物実験上で再現することは不可能です。多くの神経変性疾患はsporadicに起こってきます。このような現象を実験動物上で再現することは事実上不可能です。また、疾患発生に遺伝子的背景がある場合でも、DNA塩基配列の変化を伴わない後天的遺伝子制御メカニズムが作用して発症に至ることも多く、このようなepigeneticな現象を実験動物において正確に再現することも困難です [17,52]。ちなみに、Parkinson病のうち純粋にgenetic mutationsによってのみ発症する例は10%前後にすぎないと言われていますので [2]、大半のParkinson病は実験動物上では再現できないと考えられます。

しかし、このような本質的な限界はあるものの、動物実験モデルが病態の一部でも反映していれば、その部分を利用することによって可能性のある治療方法を見いだす糸口を得ることができます [102]。したがって、ここで重要なことは、ヒトの疾患病態から乖離した現象を動物実験モデルから可能な限り排除することに尽きると言えます。

聴神経再生実験では、まず「有毛細胞は障害されないで、聴神経だけが選択的に変性する」動物実験モデルが必要です。このために、後述するように現在2種類の動物実験モデルが使用されています。それらを具体的に説明する前に、内耳に特有な膜構造の説明が必要となります。

ヒトの有毛細胞は膜迷路の中に入っていて、膜迷路全体は側頭骨の中に埋没して固く保護されています。従って、外部から有毛細胞に直接到達しようとすると、まず骨を削って膜迷路に到達して膜にメスを入れる必要があります (図 6 A, B, C, D) [118]。Aは、外リンパ液  (perilymph) が入っている鼓室階 (Scala tympani) に入っていく経路を示しています。ただし、外リンパ腔全体が骨の中に埋まっているのではなく、正円窓と呼ばれる部分だけは膜構造になっています。外リンパ腔は、蝸牛小管 (cochlear aqueduct, CA) を介して髄液腔とつながっています。鼓室階は聴神経の細胞体 (ラセン神経節細胞spiral ganglion cell, SGC) が収納されているRosenthal’s canal (RC) と交通があるので(図6 CPS) [35,110,124]、鼓室階に入った薬剤はRosenthal’s canal到達します。この経路を利用するのが、現在用いられている薬剤による聴神経変性モデルです(下述)。また、鼓室階は、前庭階 (Scala vestibuli) とhelicotremaで交通しています。Bは、蝸牛側壁に穴を開けて中央階 (scala media) に入る経路です [88]。また、三半規管に入った後に蝸牛方向に進む方法もあります [57]。

聴神経に到達する方法として、Dは鼓室階経由で聴神経に到達します。これも動物実験で多用されていますが [89]、やはり膜迷路が破綻します。一方、Eは膜迷路にメスを入れないので唯一の方法です。膜迷路にメスを入れる方法(A~D)では、内または外リンパ液が漏れてしまうので難聴を来す危険性があります [83]。従って、A-Dの経路をつかって難聴治療をすること(細胞移植のなど)は、治療行為自体が難聴発生の危険性を内包しているのでヒトでは使えない可能性があります。また注意をしないといけないことは、これらの経路の中には、 蝸牛全体が側頭骨基部から飛び出ている実験小動物(モルモットなど)では実施可能であっても、蝸牛全体が側頭骨内に深く埋没しているヒトには適応が困難~不可能なものもあるということです。なお、聴神経への細胞移植方法については、2014年の時点でまとめた総説がありますので参考にしていただければ幸いです [117]。

 

sekiya

  

6 外部から内耳へのアプローチ (細胞移植の場合)

(cited from Sekiya, T. et al.,Neurosurgery, 2007. 60: 417-33)

薬剤変性実験モデル

前述しましたように「選択的聴神経変性モデル」の一つとして、 薬剤によるものが広く行われています。 たとえば、ウワバイン (Ouabain) (inhibitor of Na+ - K+ pump) という薬剤を、正円窓の膜上に置く方法があります。ウワバインは膜を通して外リンパ液腔に染み込みます [44,68](図6)。それが、次第に稀釈されてラセン神経節細胞(=聴神経)まで到達します。ウワバインによるラセン細胞変性は、ウワバインの濃度に依存して起こりますので、充分に稀釈されていないとラセン神経節細胞だけでなく有毛細胞までも障害されてしまいます [44]。このようなことが起こると、純粋な選択的聴神経変性は作成できません。それともう一点、Na+-K+ pumpは内耳内外に広く分布しているので、ウワバインがどの範囲まで到達するのか、その影響についても注意する必要もあるでしょう。

Mechanical Compression Model 

ラット聴神経を機械的に圧迫するという極めて単純な方法によって、有毛細胞を温存したままで聴神経だけに選択的に障害することができます (その結果、聴神経変性~蝸牛神経核~さらに上位にある聴覚神経路の変性が起こります)[80,113-122]。図6のE の経路を使用しますので膜迷路破綻は起こりません。また細い鋼線で聴神経を圧迫するだけなので、実験操作の直接的影響は聴神経以外には及びません。聴神経を圧迫する程度と圧迫持続時間を変化させることによって、さまざまの程度の聴神経変性を作成することができ、脳幹の蝸牛神経核 (cochlear nucleus) に起こる変化も定量的に明らかになっています [122]。以上のことから、有毛細胞~ラセン神経節細胞~蝸牛神経核の全部位の変化を包括的かつ定量的に評価できます(ちなみに、手術操作の全過程 = 皮膚切開から聴神経を露出終了までに要する時間は15~20分程度で、術後1時間以内にラットは覚醒、術当日夜から摂食・飲水しますので、外科的侵襲の程度はそれほど大きくはありません。ラットを年単位の長期間生存させることも可能です)。神経変性疾患の細胞移植治療は、慢性期に生じるglial scarの神経再生阻害性との「戦い」であることは上述しましたが、この実験モデルでは、そのような慢性病態を確実に再現するために聴神経圧迫後5週間待ってから聴神経への細胞移植操作が行われています [115]。

 

細胞移植の方法

神経内移植法 (intra-neural transplantation)(図7 右)

神経系への細胞移植方法には、神経内移植法、髄腔内移植法、静注法などさまざまなものが報告されています [39,90,94,95]。この中で、現在まで最も汎用されて来たのが「神経内移植法 (intra-neural injection)」 です。注射針やカテーテルを病巣内またはその近接部位に刺入して細胞を注入する方法で、最も確実性が高く効果的であるとa prioriに信じられてきました [94,131]。しかし、この方法の確実性と有効性を科学的に証明した研究は、これまでありません [90]。神経内移植法では、しばしば複数以上の部位を注射針などで刺入して細胞が注入されており、中にはヒト脊髄の左右に5カ所ずつ合計10カ所を刺入している報告もあります [12,94]。しかし、中枢神経組織を針などで刺す操作そのものが本質的に侵襲的であることは自明です。この方法では、刺入による周辺神経組織の直接損傷、細胞注入圧と注入された移植細胞塊による周辺健常組織損傷が不可避的に起こることも考慮すべきでしょう。注射針刺入によって針周辺に炎症反応が起こりますし [43]、針周囲にastrocyteによるreactiveな反応が起こってきます [62]。またHuntington病患者に線条体組織片を神経内移植した症例では、10年後の剖検で移植片と周囲脳組織の間に活性化したastrocyteが認められています [22,23]。これらは、前述したglial scar formationと同列にある組織反応です。また、細胞移植から10年度のParkinson患者の剖検によると、移植組織とhostのinterfaceにT細胞, B細胞, macrophageなどの免疫炎症細胞の集積が見られています [63,64,71]。

Parkinson病患者にドーパミン産生細胞を神経内移植した場合、大半の細胞は24時間以内にアポトーシスに陥るとされ、数週間以内に90~95% の移植細胞が死滅するとされてきました [16,106,108,144]。瘢痕化した聴神経に神経内移植をした場合にも、移植された細胞は数週間のうちにほぼ全滅しています [115]。すべての神経変性疾患で、病巣部と周辺の神経組織は瘢痕化しています [4,22,41,138]。したがって、従来から実施されてきた病巣内への移植細胞の神経内移植法が「病巣そのものに細胞を注入するのだから、確実性と有効性が高い」と信じることは困難です。

神経系の再生治療において、「新たにゼロから神経系を造りだす」ということは野心的なことではありますが、多分に非現実的な側面を有しています。それよりも、「既存の残存神経機能を温存しつつ、そこに幾ばくかのものを付け加える」、つまり「CreationではなくAddition」という方針の方がrealityを持っています。このことから、治療行為に伴う侵襲性を極力低くすることが重要で、万が一にも移植操作そのものによって残存神経機能がゼロになるような事態は回避しなければなりません。

表面移植法 (Surface transplantation)(図7左)

最近、「瘢痕化した聴神経への神経内細胞移植時に、偶然に神経外に漏れ出た細胞が自ら神経内に入って行く」という現象が偶然発見されました [115]。上述しましたように、聴神経内に細胞を強制的に注入したときには、細胞は全滅してしまいました [115]。ところが、その操作中にたまたま神経の外側に漏れ出て表面に付着していた細胞が自律的に神経内は入って長期間生存していたわけです。そこで、細胞を聴神経内に注入しないで、敢えて聴神経の「表面にただ置くだけ」にしてみたところ、細胞は神経内に自ら入ってどんどんと突起を伸ばして最終的に末梢の有毛細胞、中枢の蝸牛神経核細胞とシナプスを構築し、聴性脳幹反応 (ABR) も改善しました [115]。そこで、この細胞移植方法は「表面移植法 Surface transplantation」と名付けられました [115]。

この実験では、前述のように圧迫損傷後5週間経過したラットの瘢痕化した聴神経が用いられています。これは重要なポイントです。と言うのは、難聴も含み神経変性疾患は本質的に急性疾患ではなく、何年にもわたる慢性疾患です。したがって、動物実験でもそのような慢性期病態を再現する必要があります。ある聴神経再生実験では、前述したウワバインを投与した後3~5日目に神経内に細胞を注入していますが [19]、この時期にはまだglial scarが充分に形成されていないと考えられることから、慢性期病態の再現という点で問題があります。

表面移植された細胞が自ら神経内部に入って行って生着・機能するようになった要因の一つに、BDNFがあったと考えられています [115]。瘢痕化した聴神経をchondroitinase ABC (ChABC)という酵素で前処理した後にELISA法でBDNFの量を測定していますが、酵素処理をしない瘢痕化聴神経よりも多量のBDNFが含まれていました。ChABCは上述したCSPGの側鎖GAGを消化するので、それによってBDNFの神経内での拡散が促進された可能性があります [134]。これに加えて、ChABCの側鎖消化除去作用によって、移植細胞上に発現している神経再生抑制性のreceptorsに対するligand作用が抑制されたとも考えられます(「はじめに」の項も参照)。

ラット選択的聴神経変性モデルでは有毛細胞は形態的・機能的に正常ですので [80]、有毛細胞がBDNFを産生して下流にある移植細胞を栄養しつつ、BDNFが移植細胞から伸び出てくる神経突起を有毛細胞方向に引き寄せるattractantとして作用したと考えられます [11,30,53,109,118](胎生期に有毛細胞が変性消失すると、聴神経は育ってきません。なお他に、聴神経の成長生存に不可欠なneurotrophinとしてNT-3があります)。使用された移植細胞は聴神経の前駆細胞で、BDNFに対するreceptorであるTrkBを発現していました。したがって、ligand - receptor関係が良好に築かれたことによって、移植細胞が遊走・生着して機能するようになったと考えられます。

表面移植法では神経内注入法のように神経内部に入り込む操作がないので、神経の内部構造が破壊されることがありません。瘢痕組織を壊さないことが、実は重要であることも分かりました。瘢痕化聴神経内に入った細胞は、glial scarを巧みに利用して神経突起を伸ばし遊走していました [115]。魚類や両生類の切断脊髄は再生するときに、glial bridgeという構造ができて再生神経突起の足場 (scaffold) となります(glial bridgeについて「はじめに」の項も参照)。一方、ラットでは長く伸びたglial scar由来の突起が ”glial scar bridge”となって足場の役目を果たし、移植細胞がそれに沿って神経突起を伸ばし遊走していました [115]。移植細胞はtandemに列をなして遊走しており、chain formation(細胞が鎖のようにつながる現象)もしばしば観察されました。中にはGFAP陽性のglial scar由来のトンネル状構造の内部を移植細胞が列をなして遊走している像も捉えられています [115]。これらは、胎生期に大脳の発生過程で見られるglia-guided migration [78,104] や rostral migratory stream (RMS) を彷彿とさせるものでした [46,72]。さらには、移植細胞はglial scar内のあらゆる組織を利用するようで、切断されて残存している神経を足場として遊走する細胞も認めました。これは胎生期に見られるneuron-guided migrationとよく似た細胞遊走像でした [112]。In vitroの実験で、astrocyteと神経細胞を共培養すると、神経突起がastrocyteに沿って伸びるだけでなく離れたastrocyteの突起にjumpするという像も報告されています [133]。以上のことから、移植細胞はその周辺にあるあらゆる構造的(glial scar, そこから伸びる突起や残存神経組織など)、化学的なcues(BDNFなど)を使って生着・機能しようとするもののようです。表面に移植された細胞の神経突起が脳幹深く伸びて、シナプスを構成している所見も得られています [115]。したがって、表面移植法は比較的表層に位置する神経系のみならず、さらに深部にある神経組織の再構築にも適用できると考えられます。

上述しましたように、神経内移植では移植された細胞の多くが急性期に急速に死滅します。その最大の原因は栄養不足にあると考えられます。したがって、移植直後から長期にわたって栄養 nutrientsが供給される部位に細胞を移植することが必要です。たとえば、移植細胞だけを大脳の中に注入しても、そこには栄養源となるものがありません。したがって、移植直後に使用できる栄養を細胞と一緒に移植することが重要になってきます [117]。しかし、神経内移植法で移植直後の細胞生存のために充分な栄養を確保しようとすると、[移植細胞]+[栄養源]の塊が巨大になって [73]、hostの残存神経組織が破壊されるという難しい問題が起こります。これに対して、表面移植法では栄養素も細胞と一緒に表面に置くだけなので、このような問題を生じることが理論的にありません。

現在までに神経内細胞移植を行うときの至適細胞数は知られていません [93]。 疾患ごとに、また病気の進行具合によって至適細胞数は異なるはずです。しかし、表面移植法では、移植細胞は強制的に注入されるのではなく、細胞を受ける側 (host) の許容範囲内において、必要に応じて (on demand)、 細胞自ら自律的に神経内に入っていくので、至適細胞数の問題は事実上解決することになります。

7

図7 神経内移植法と表面移植法

京都大学HPより転載:
http://www.kyoto-u.ac.jp/ja/research/research_results/2015/150616_1.html

 

結語

本サイトのタイトルを「聴神経機能再生 “Creation” or “Addition”?」としました。上述しましたように、ここでの立場は、「神経系をゼロから造る」ということではなくて、「既存の残存神経機能を極力温存しつつ、幾ばくかのものを付け加えることによって機能を再生させる」ということです。このためには、細胞移植法を可能な限りless invasivenessにするという姿勢が重要で、これが表面移植法Surface transplantationを提唱する背景にある思想です。

この移植方法は、さまざまな神経変性疾患にも適用できるのではないかと考えております。ALSでは、下位運動神経(図 5 A)もしばしば変性します [85]。このとき、変性硬化した脊髄前根神経上に運動神経前駆細胞を表面移植すること、また同じく脊髄前角細胞が変性するポリオ (poliomyelitis) [54] に対しても同様の治療が可能かもしれない、などなどさまざまな適用を考えることができます。

表面移植された細胞の神経突起が脳幹深部へと向かう像が観察されたことはすでに述べました。表面移植法は「表面」という語を含んでいますが、神経系の表層に位置する神経系だけがこの移植方法の適応となるという意味では決してありません。「表面」は、あくまでも移植方法に関して述べた言葉です。表面移植法が無効なような移植対象(疾患)は、そもそもいかなる方法を取るにせよ、細胞移植治療の対象とはなり得ないのかもしれない、そのような可能性も否定することはできません。

ところで、中枢神経系の最大の特徴の一つは、そのRedundancyにあります。それは、ある神経回路を構成している神経線維が「ほんの少ししか」残ってなくても、その神経回路が機能するように作られているということを意味しています。たとえば、歩行は脊髄運動神経の5-10%が残っているだけで可能とされています [10,37,139]。聴神経についても、人工内耳が有効になるためには全聴神経の~10%程度が残っていればよいとさえ言われています [105]。一方、重度の麻痺肢であっても、運動神経線維が全滅していることはなく、かなりの数の神経線維が残存していることが知られています [15]。ただ、その数が少なすぎるというだけで、ゼロではないのです。以上のことは、機能が廃絶してしまっているように見える神経路でも残存神経は必ずあるので、そこにほんの少しの神経線維を付け加えることによって、患者さんが歩けるようになったり、聞こえるようになったりする可能性があるということを強く示唆しています。

以上、本稿では細胞移植による聴神経機能再生研究が徐々に進展してきている姿を見てきました。今後、臨床応用に向けて、さらなる精進を積み重ねていくことが求められています。

 

御願い:

本サイトにアクセスしていただき、ありがとうございました。なお、下記のことにつきよろしく御願いいたします。メール、御手紙、御電話などによる「個別の症例」についてのお問い合わせへの対応は控えさせていただきたいと考えております。直接対面しないまま、さまざまなアドバイス等を行うことにつきましては、常に慎重であらねばならないと考えております。また、「いつごろ、どのような再生医療がどの程度まで現実のものとなるのか?」ということは、どなたも最も知りたい点です。しかし、医療の進歩は、ゆっくりとスロープ状に進展することもあれば、階段状にどんどんと進む場合もある。そして、そのようなことが、どのようにして、どの時点で起こるかは、だれにも予測することができません。このような事情も、よろしく御理解いただけますよう御願い致します。その他のことにつきましては、御遠慮なく何なりとメールをいただけますと幸いに存じます。

 

略語集(本文中でfull spellingを示したものは、一部下記から除いています):

ABR; auditory brainstem response, ALS; amyotrophic lateral sclerosis, Arp2/3; actin-related protein 2/3, BDNF; brain-derived neurotrophic factor, CA; cochlear aqueduct, Cdc42; cell division cycle 42, CN; cochlear nucleus, CNS; central nervous system, CP; cerebellopontine, CPS; canaliculae perforantes of Schuknecht, CSPG; chondroitin sulfate proteoglycans, DCC; deleted in colorectal carcinoma, ECM, extracellular matrix; ELS; endolymphatic sac; Ena/VASP; enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein, F-actin; filamentous actin, G-actin; globular actin, GAG; glycosaminoglycan, GAP; GTase activating protein, GEF; guanine nucleotide exchange factor, GFAP; glial fibrillary acidic protein, GTP; guanosine triphosphate, HC; hair cell, IAC; internal auditory canal, LIMK; LIM-domain-containing protein kinase, mDia; mammalian homolog diaphanous, MLC; myosin regulatory light chain, MLCK; myosin light chain kinase, MLCP; myosin light chain phosphatase, NgR; Nogo-66 receptor, NT-3; neurotrophin 3, N-WASP; neuronal Wiskott-Aldrich Syndrome protein, PAK; p21-activated kinase, PNS; peripheral nervous system, Rac1; Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, RC; Rosenthal’s canal, Rho; Ras homologous member, Robo: Roundabout, ROCK; Rho-associated kinase, Sema; semaphorin, SGC; spiral ganglion cells, SSH; slingshot, Trk; tyrosine receptor kinase, TZ; transitional zone, VA; vestibular aqueduct, WASP; Wiskott–Aldrich Syndrome Protein, WAVE; WASP family verprolin-homologous protein

 

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最終更新:2016年7月2日 2:39

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